在高鹽和低pH值的條件下，核酸純化柱中的硅膠膜對(duì)核酸有專一性的吸附力，對(duì)其他組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而能很好地分離純化核酸。質(zhì)粒純化柱作為核酸純化柱的一種，用于分離提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒純化柱的優(yōu)劣直接決定質(zhì)粒DNA試劑盒的性能--那怎么評(píng)估質(zhì)粒純化柱的性能呢？這里就涉及一個(gè)質(zhì)粒純化柱飽和吸附能力的問(wèn)題，今天我們就設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試不同質(zhì)粒純化柱的吸附極限。

在實(shí)驗(yàn)前一天先挑選一種含高拷貝的質(zhì)粒的細(xì)菌進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前先取培養(yǎng)好的3 ml菌液進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取（步驟參考Simgen 快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒操作說(shuō)明書），用60 μl Buffer E 洗脫，測(cè)量DNA濃度結(jié)果如下：

平均3ml獲得質(zhì)粒DNA的總量是338×60=20,280 ng，即20.28 μg。因此估算得到每毫升菌液大約含有質(zhì)粒6.7 μg。

接下來(lái)是具體的實(shí)驗(yàn)方法：本次實(shí)驗(yàn)選取了實(shí)驗(yàn)室中4種不同的純化柱各2個(gè)，分別編號(hào)為A（simgen質(zhì)粒小提中量試劑盒配套使用，標(biāo)記為1、2）、B(Simgen 快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒配套使用標(biāo)記為3、4)、C（標(biāo)記為5、6）和D（標(biāo)記為7、8）。為了確保純化柱能夠達(dá)到飽和吸附，必須使得有充分過(guò)量的質(zhì)粒DNA加入到純化柱中，所以本次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)純化柱中加入了15 ml菌液中所含質(zhì)粒DNA的量，考慮到增大菌量后菌體中質(zhì)粒DNA的釋放效率會(huì)有所下降，粗略估計(jì)加入純化柱質(zhì)粒DNA大約在80~100 μg之間。

操作步驟（更詳細(xì)的步驟參見(jiàn)simgen質(zhì)粒小提中量試劑盒）如下:

1、取14個(gè)2 ml離心管各收集10 ml菌液；

2、加入500 μl Buffer Ⅰ，充分懸浮；

3、加入500 μl BufferⅡ，溫和翻轉(zhuǎn)離心管使細(xì)菌裂解釋放質(zhì)粒；

4、加入700 μl Buffer Ⅲ，充分溫和翻轉(zhuǎn)離心管使其完全中和（沉淀物顏色變為淡黃色），12000 rpm離心10 min

5、將所有上清液混合在一起，用移液槍量取800 μl加入各個(gè)純化柱，離心去濾液，重復(fù)3次，確保加入過(guò)量的質(zhì)粒DNA用于吸附（此處是重點(diǎn)?。。。?/span>

6、依次用500 μl Buffer W1和700 μl Buffer W2進(jìn)行洗滌

7、純化柱上的質(zhì)粒DNA用100 μl Buffer E 洗脫

獲得的質(zhì)粒DNA測(cè)量結(jié)果如下：

結(jié)果顯示，飽和吸附量最高的是質(zhì)粒純化柱A，平均能夠吸附約49 μg以上的質(zhì)粒DNA，飽和吸附量最低的是質(zhì)粒純化柱B，但平均也能吸附約34 μg以上的質(zhì)粒DNA。

對(duì)于質(zhì)粒純化柱性能的評(píng)估，很多廠家沒(méi)有進(jìn)行質(zhì)粒DNA飽和吸附能力的測(cè)試，因此就很難客觀評(píng)價(jià)純化柱的優(yōu)劣。實(shí)際上純化柱A、B、C、D中加入的質(zhì)粒DNA在未達(dá)到飽和的前提下（比如通常的從1-5 ml 菌液中提取質(zhì)粒DNA）純化DNA，獲得的質(zhì)粒DNA濃度差異不大，但是如果加入過(guò)量的質(zhì)粒DNA，差異就體現(xiàn)出來(lái)了。

根據(jù)我們以往的測(cè)試結(jié)果來(lái)看，國(guó)產(chǎn)硅膠膜材質(zhì)制作的質(zhì)粒純化柱的飽和吸附能力普遍低于進(jìn)口的硅膠膜材質(zhì)（本次實(shí)驗(yàn)測(cè)試的質(zhì)粒DNA純化柱均用進(jìn)口硅膠膜組裝），所以對(duì)純化柱進(jìn)行飽和吸附能力測(cè)試也是一個(gè)有參考意義的鑒別的方法。

另外經(jīng)常做質(zhì)粒DNA提取的同學(xué)也可以回想一下平時(shí)提取質(zhì)粒時(shí)的情況，如果使用的是Simgen質(zhì)粒DNA試劑盒，可能純化柱還有好多吸附空間都白白浪費(fèi)了?，F(xiàn)在有了這個(gè)最大吸附飽和度的數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)中也可以計(jì)劃下如何最大限度地利用純化柱的吸附能力；針對(duì)一些低拷貝的質(zhì)粒如果采用多次過(guò)柱的方法得到較高的濃度，也是一種不錯(cuò)的運(yùn)用哦。

新景實(shí)驗(yàn)室